(sust. m.) — [Técnicas de laboratorio / Histología / Citoquímica de lípidos / Histoquímica diferencial] — Ingl.: _Nile blue_; _Nile blue A_; _Nile blue sulfate_; _Nile blue sulphate_; C.I. 51180
**Descripción:** El azul Nilo (sulfato de Nilo azul A) es un **colorante histoquímico diferencial para la detección y clasificación de lípidos en secciones de tejido**, cuya propiedad más útil es que discrimina entre dos clases de lípidos con dos colores distintos: los **lípidos neutros** (triacilgliceroles, ésteres de colesterol, esteroides no ionizados) se tiñen de **rojo-rosado** (porque son marcados por el **rojo Nilo** [_Nile red_], el producto de oxidación/hidrólisis del azul Nilo que está presente como contaminante en el colorante comercial); y los **lípidos ácidos o cargados** (ácidos grasos libres, fosfolípidos, glucolípidos, crolipidos) se tiñen de **azul** (por la unión iónica del catión del azul Nilo con los grupos carboxilato o fosfato cargados negativamente de estos lípidos); en el contexto de las [[termitas]], el azul Nilo es la herramienta histoquímica más selectiva para el estudio del **[[cuerpo]] graso** (_fat body_) de las distintas castas — el órgano de reserva energética lipídica de la termita —, para distinguir entre lípidos de reserva (TAGs; rojos) y lípidos de membrana/señalización (fosfolípidos; azules), y para estudiar cómo varía el perfil lipídico del cuerpo graso en función de la casta, el estado reproductivo, la exposición a insecticidas o la eliminación de microbios simbiontes.
**Descripción ampliada:**
## Identidad química: azul Nilo A vs. rojo Nilo — la confusión histórica
El término "azul Nilo" en la literatura de histoquímica se refiere a un **compuesto benzofenoxacínico** con fórmula molecular C₂₀H₂₀ClN₃O (sulfato: C₄₀H₄₀N₆O₆S); se distingue claramente del **rojo Nilo** (_Nile red_; 9-dietilamino-5H-benzo[α]fenoxazin-5-ona; C₂₀H₁₈N₂O₂; CAS 7385-67-3), que es su producto de oxidación/hidrólisis y que es el responsable de la tinción roja de los lípidos neutros cuando se usa la preparación comercial de azul Nilo A:
|Propiedad|**Azul Nilo A** (_Nile Blue A_)|**Rojo Nilo** (_Nile Red_)|
|---|---|---|
|**Fórmula molecular**|C₂₀H₂₀ClN₃O (sal clorhidrato)|C₂₀H₁₈N₂O₂|
|**CAS**|3625-57-8 (clorhidrato); 2381-85-3 (sulfato)|7385-67-3|
|**C.I.**|C.I. 51180|—|
|**Origen**|Colorante sintético oxacínico|Producto de oxidación/hidrólisis del azul Nilo|
|**Color en solución acuosa**|Azul intenso|Naranja-rojo|
|**Lípidos que tiñe**|**Lípidos ácidos y cargados**: ácidos grasos libres ≥C₁₆ insaturados (_cis_), fosfolípidos, glucolípidos → **azul**|**Lípidos neutros**: TAGs, ésteres de colesterol, esteroides → **rojo/naranja-dorado** (fluorescencia)|
|**Mecanismo de tinción**|Unión iónica del catión del dye con los grupos carboxilato (COO⁻) y fosfato (PO₄²⁻) de los lípidos ácidos|Disolución en el núcleo hidrófobo de las gotas de lípidos neutros (solvatocromía)|
|**Modo de uso**|Solución acuosa 0,1 mg/mL (crio o parafina, previa extracción del parafín); pH ácido (ácido acético 1%) diferencia mejor las dos fracciones|Solución en DMSO o acetona (0,5–1 mg/mL → diluir en tampón); fluorescencia|
|**Detección**|Microscopia de luz (campo claro): azul vs. rojo|Microscopia de fluorescencia: excitación 488–560 nm; emisión 580–640 nm (TAGs)|
- La preparación comercial de **azul Nilo A sulfato** (Sigma-Aldrich N3136; Merck) contiene invariablemente una **fracción de rojo Nilo** como impureza de síntesis o de envejecimiento del colorante; esto es funcionalmente ventajoso para la histoquímica diferencial de lípidos: al aplicar azul Nilo A sobre una sección, los lípidos neutros son marcados por el rojo Nilo impureza (tinción roja) y los lípidos ácidos/cargados son marcados por el azul Nilo catiónico (tinción azul) — permitiendo la distinción doble en una sola preparación; si se desea tinción solo de lípidos neutros sin el fondo azul, se usa rojo Nilo puro (síntesis purificada).
## Mecanismo dual de tinción: azul + rojo en la misma sección
- **Tinción azul (lípidos ácidos/cargados):** La oxacina catiónica del azul Nilo (carga positiva en N) se une por **unión iónica electrostática** a los grupos carboxilato ionizados (ácidos grasos libres; –COO⁻) y a los grupos fosfato (fosfolípidos; –PO₄²⁻) de los lípidos con carga negativa a pH fisiológico; la unión iónica es reversible y se optimiza a pH ligeramente ácido (~3–5 en el protocolo de tinción) para protoner los carboxilatos de débil pKa y favorecer la discriminación; el resultado es coloración azul intensa en: membranas celulares (fosfolípidos de membrana), ácidos grasos libres de cadena larga, gránulos de eritrocitos nucleares, y en las [[termitas]]: las **membranas de las células del cuerpo graso** y los **fosfolípidos de las gotas lipídicas en la periferia** de los adipocitos.
- **Tinción roja/rosada (lípidos neutros — vía rojo Nilo impureza):** El rojo Nilo (contaminante del azul Nilo comercial) es un colorante **solvatocrónico** extremadamente lipofílico: se disuelve preferentemente en el **núcleo hidrófobo** de las gotas de lípidos neutros (TAGs; ésteres de colesterol) y emite fluorescencia naranja-amarilla dorada (λem ~580 nm; visible en campo claro como tinción roja/rosada difusa) y fluorescencia roja en ambientes lipídicos más polares (fosfolípidos de membrana, λem ~630 nm); en campo claro (microscopia convencional sin fluorescencia), el rojo Nilo impureza produce una **tinción roja a rosada** en las gotas lipídicas de TAGs — perfectamente distinguible del azul de los fosfolípidos.
## Aplicación al cuerpo graso de las termitas
- El **cuerpo graso** (_fat body_) es el tejido diana más importante del azul Nilo en las termitas: es el órgano de reserva lipídica (TAGs → rojos con azul Nilo), de síntesis de vitelogenina (en las reinas), de almacenamiento de ácido úrico (cristales blancos que no se tiñen con azul Nilo porque el [[ácido úrico]] no es un lípido) y de síntesis de proteínas de fase aguda y de inmunidad; la tinción con azul Nilo de criosecciones del abdomen de distintas castas de termitas permite visualizar directamente:
1. El **tamaño y densidad de las gotas lipídicas** (lipid droplets; LDs) en los adipocitos del cuerpo graso: TAGs en rojo → gotas grandes y densas en los alados (reservas para el vuelo) + en las reinas (reservas para la viteligénesis) vs. gotas pequeñas y escasas en los soldados
2. La **ratio TAGs/fosfolípidos** (rojo/azul): en las obreras la ratio es intermedia; en los alados hembra antes del vuelo nupcial la ratio TAGs/fosfolípidos es máxima (preparación para el vuelo)
3. El **efecto de la eliminación de microbios simbiontes** sobre el metabolismo lipídico: el estudio en moscas tse-tsé (PMC 10391724) usó el protocolo azul Nilo para demostrar que la eliminación de la simbionte _Wigglesworthia_ alteraba profundamente la ratio fosfolípidos/TAGs en el [[cuerpo]] graso; un protocolo análogo aplicado a termitas tratadas con antibióticos para eliminar los microbios del [[intestino]] posterior revelaría cambios similares en el cuerpo graso de las [[termitas]]
## Protocolo de tinción con azul Nilo A para secciones de termita
|Paso|Detalle|
|---|---|
|**Fijación**|Paraformaldehído 4% en PBS; 4 °C; overnight (si se quiere preservar los lípidos in situ y evitar su extracción)|
|**Sección**|**Criosección** (congelación + criostato; cortes de 10–14 μm; **obligatorio**: las secciones en parafina disuelven los lípidos neutros durante el procesado → no válidas para la fracción de TAGs); alternativamente: vibratomo con tejido fresco sin fijar|
|**Solución de tinción**|Azul Nilo A sulfato 0,1 mg/mL en agua destilada; sin ácido si se quiere la doble tinción azul+rojo; con 1% ácido acético en el lavado posterior para acidificar y mejorar la discriminación entre las dos fracciones|
|**Tinción**|20–30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad|
|**Lavado**|3 lavados en PBS (1 min cada uno) para eliminar el exceso de dye|
|**Montaje**|En glicerina o medio de montaje acuoso (no solventes orgánicos → disuelven los lípidos)|
|**Observación**|Microscopio de campo claro: lípidos neutros (TAGs) en **rojo-rosado**; lípidos ácidos (FFA, fosfolípidos) en **azul**; núcleos y citoplasma en azul pálido|
|**Fluorescencia (opcional)**|El rojo Nilo impureza fluoresce: excitación 488–560 nm; emisión 580–640 nm (TAGs); útil para confocal|
**Ayuda para entender:** Si el rojo neutro es el "papel tornasol" del virólogo celular (detecta si la célula está viva o muerta), el azul Nilo es el "papel tornasol del bioquímico lipídico" de la termita: le dice no solo **dónde hay lípidos** en el tejido, sino también **de qué tipo son** — y en la termita esto es crucial porque la misma gota de lípidos puede contener en su interior TAGs de reserva energética (rojo) rodeados de una capa de fosfolípidos de membrana (azul), que es exactamente la estructura de las gotas lipídicas de todos los insectos. La ventaja práctica en el laboratorio termitológico es que se puede determinar con una sola preparación de criosección teñida con azul Nilo si una termita de una casta determinada tiene sus reservas de vuelo (TAGs) intactas antes del vuelo nupcial, o si el tratamiento con un IGR ha alterado la composición del cuerpo graso en las obreras expuestas al cebo.
**Sinónimos:** Azul Nilo (Esp.; denominación estándar; frecuentemente usado sin el sufijo "A" ni "sulfato"); azul Nilo A (Esp./Ingl.; incluye la especificación del isómero A, que es el utilizado en histoquímica; distingue del "azul Nilo B" que es un isómero diferente); sulfato de azul Nilo A (_Nile blue A sulfate_ / _Nile blue sulfate_; la sal de sulfato es la forma comercial más común: Sigma N3136); _Nile blue_ (Ingl.; denominación estándar internacional; = azul Nilo); C.I. 51180 (_Colour Index_ 51180; la denominación inequívoca en la industria de colorantes); CAS 3625-57-8 (clorhidrato) / 2381-85-3 (sulfato).
**Términos relacionados:** Rojo Nilo (_Nile red_; 9-dietilamino-5H-benzo[α]fenoxazin-5-ona; CAS 7385-67-3; el producto de oxidación/hidrólisis del azul Nilo; tiñe los lípidos neutros [TAGs, ésteres de colesterol] en rojo/naranja-dorado [campo claro] o fluorescencia naranja-dorada [λem 580 nm; excitación 488 nm]; presente como impureza en el azul Nilo comercial; responsable de la tinción roja de los TAGs en el protocolo de azul Nilo; también disponible puro como fluorocromo para microscopía de fluorescencia y confocal); cuerpo graso (_fat body_; tejido diana principal del azul Nilo en las termitas; reserva de TAGs [gotas lipídicas; teñidas en rojo por el rojo Nilo impureza] + membrana de los adipocitos y fosfolípidos [teñidos en azul por el azul Nilo catiónico]; en los alados: gotas lipídicas grandes y densas [reservas de vuelo]; en los soldados: gotas lipídicas pequeñas y escasas; en las reinas fisogástricas: cuerpo graso hipertrofiado con alta densidad de gotas de DAGs para la viteligénesis); gota lipídica (_lipid droplet_, LD; orgánulo intracelular; núcleo de TAGs + capa de fosfolípidos + proteínas de la familia perilipina; en el azul Nilo: núcleo de TAGs teñido en rojo-rosado + capa periférica de fosfolípidos teñida en azul; estructura concéntrica bicolor visible a 400–600× en campo claro o confocal); solvatocromía (_solvatochromism_; la propiedad por la que el rojo Nilo cambia el color de su fluorescencia según la polaridad del medio en el que se disuelve: λem 580 nm en lípidos neutros [apolar] → λem 630 nm en fosfolípidos de membrana [más polar] → prácticamente sin fluorescencia en agua [muy polar]; la solvatocromía del rojo Nilo es la base de su uso como detector diferencial de lípidos neutros vs. polares).
**Bloque:** Técnicas / 125. Azul Nilo: **colorante histoquímico diferencial para lípidos**; fórmula: C₂₀H₂₀ClN₃O (clorhidrato); C.I. 51180; CAS 3625-57-8 (clorhidrato) / 2381-85-3 (sulfato); mecanismo dual: (1) **azul Nilo catiónico** → unión iónica con lípidos ácidos/cargados (ácidos grasos libres ≥C₁₆ insaturados _cis_, fosfolípidos, glucolípidos) → tinción **azul** (membranas; fosfolípidos); (2) **rojo Nilo impureza** (contaminante inevitable del azul Nilo comercial; producto de oxidación) → solvatocromía en el núcleo hidrófobo de los TAGs + ésteres de colesterol → tinción **roja/rosada** (gotas lipídicas neutras) + fluorescencia λem 580 nm; el azul Nilo comercial produce la **doble tinción diferencial azul + rojo en una sola preparación**; aplicaciones en termitas: **tinción del [[cuerpo]] graso** de criosecciones abdominales de distintas castas: gotas de TAGs (rojas) + membranas de fosfolípidos (azules); la ratio rojo/azul en el cuerpo graso del alado = máxima (reservas de vuelo); soldado = mínima (casi sin TAGs); uso diagnóstico: efecto de insecticidas / IGR / eliminación de simbiontes sobre el metabolismo lipídico del cuerpo graso; protocolo: criosección 10–14 μm (obligatorio; parafina destruye los lípidos neutros) + azul Nilo A sulfato 0,1 mg/mL acuoso, 20–30 min, oscuridad + lavado PBS + montaje en glicerina + observación campo claro o fluorescencia (TAGs: excitación 488–560 nm; emisión 580–640 nm); **no confundir** con rojo Nilo puro (fluorocromo para lípidos neutros sin la fracción azul; λem 580 nm [TAGs]; CAS 7385-67-3).
**Fuentes (source):**
- Brookhaven et al. (PMC 10391724 / biorxiv 2022). _Lipid metabolism dysfunction following symbiont elimination in tsetse_ (_Current Biology_ 2023). Protocolo de tinción con azul Nilo A sulfato (Sigma) para cuerpo graso de _Glossina_: 0,1 mg/mL acuoso; 30 min; lavado PBS; montaje en glicerina; microscopio Zeiss Axio Vert.A1; tinción diferencial azul (fosfolípidos) + rojo (TAGs y diacilgliceroles); cuantificación RGB en Photoshop.
- Smith (1907; reproducido en Zenodo 2509729). _The staining of fat by Nile blue sulphate_ (_Quart. J. Micr. Sci._ 1907). La descripción original del uso del azul Nilo sulfato como colorante de grasa en preparaciones acuosas de tejido; base histórica de todos los protocolos modernos de tinción de lípidos con azul Nilo.
- Focalplane.biologists.com (2021). _Using Nile Blue and Nile Red to visualise lipids in cryosectioned tissues_. Protocolo moderno detallado: criosección obligatoria; fluorescencia del rojo Nilo impureza para TAGs; azul Nilo fluoresce en presencia de ácidos grasos insaturados ≥C₁₆ (_cis_); tinción concéntrica: núcleo rojo (TAGs) rodeado de señal azul (ácidos grasos libres de la periferia de la gota).[](https://focalplane.biologists.com/2021/09/14/using-nile-blue-and-nile-red-to-visualise-the-presence-of-lipids-in-cryosectioned-tissues/)
- Conductscience (2024). _Histochemical techniques to demonstrate lipids_. Tinción de lípidos con azul Nilo: principio (mezcla de oxacina azul + oxazolona roja); procedimiento; observación: lípidos neutros → rojo-rosado; lípidos ácidos → azul.[](https://conductscience.com/histochemical-techniques-to-demonstrate-lipids/)