(sust. m.) — [Técnicas de laboratorio / Histología / Citología / Viabilidad celular / Toxicología in vitro] — Ingl.: _neutral red_ (NR); _toluylene red_; _Basic Red 5_; C.I. 50040 **Descripción:** El rojo neutro es un **colorante eurodina catiónico supravital** (_supravital eurhodin cationic dye_) de amplio uso en histología, citología y toxicología in vitro, cuyo principio de funcionamiento se basa en una propiedad única: **solo las células vivas y metabólicamente activas lo incorporan y lo retienen**, mientras que las células muertas o dañadas no; en el contexto específico de las [[termitas]], el rojo neutro es una herramienta técnica aplicada principalmente en dos contextos: (1) **histología del tubo digestivo** — tinción de las células epiteliales del [[intestino]] medio, del intestino posterior y de los lisosomas de los protozoos flagelados del paunch —; y (2) **ensayos de viabilidad celular** (_neutral red uptake assay_, NRU) en estudios de toxicidad de insecticidas sobre células intestinales o cultivos de células de [[Blattodea]]-Isoptera para determinar el efecto citotóxico de plaguicidas, IGR u otros xenobióticos. **Descripción ampliada:** ## Identidad química y propiedades fisicoquímicas |Propiedad|Valor| |---|---| |**Nombre IUPAC**|3-amino-7-dimetilamino-2-metilfenocina (cloruro de 3-amino-7-(dimetilamino)-2-metilfenocinio)| |**Número CAS**|553-24-2 (sal de cloruro)| |**Fórmula molecular**|C₁₅H₁₇ClN₄| |**Masa molecular**|288,78 g/mol| |**Número C.I.**|C.I. 50040 (_Colour Index_)| |**Nombre comercial**|Neutral Red; Toluylene Red; Basic Red 5| |**Clase química**|Eurodina (_eurhodin_); colorante catiónico básico| |**pKa**|6,81 (a pH fisiológico está principalmente en forma neutra no cargada [NR]; en pH ácido [<6,8] está en forma cargada catiónica [NRH⁺])| |**Color en solución**|Rojo a pH ácido; amarillo a pH alcalino (pH > 8) → **indicador de pH**| |**Solubilidad**|Soluble en agua y en etanol| |**Absorbancia máxima**|540 nm (forma roja/catiónica, pH ácido)| ## Mecanismo de incorporación celular: la clave lisosomal - El mecanismo molecular por el que el rojo neutro discrimina entre células vivas y muertas depende de la fisiología lisosomal y del gradiente de pH intracelular: 1. A pH fisiológico extracelular (~7,4), el rojo neutro está en **forma neutra no cargada (NR)** → puede atravesar libremente la membrana plasmática por **difusión pasiva no iónica** (no requiere energía, no hay transportador específico) 2. Una vez en el citoplasma (pH ~7,2), el rojo neutro se distribuye pasivamente por toda la célula y penetra en los orgánulos membranosos, incluidos los **lisosomas** (pH luminal 4,5–5,5) 3. Dentro del lisosoma, el bajo pH convierte el rojo neutro en su **forma catiónica protonada (NRH⁺)** → esta forma catiónica no puede salir del lisosoma a través de la membrana lipídica (la carga positiva impide la difusión pasiva) → el dye queda **atrapado en el lisosoma** por el gradiente de pH 4. El NRH⁺ se une además por **enlaces electrostáticos e hidrófobos** a grupos aniónicos y fosforilo de la matriz lisosomal, aumentando la retención 5. En una **célula muerta o dañada**: la ATPasa-H⁺ lisosomal (que acidifica activamente los lisosomas usando ATP) está inactiva → el gradiente de pH lisosomal colapsa → el rojo neutro no queda atrapado → la célula muerta no se tiñe de rojo - La **integridad lisosomal con retención del rojo neutro** es un indicador de viabilidad celular **más sensible** que la exclusión del azul de tripán (que solo detecta la ruptura de la membrana plasmática, un evento tardío en la muerte celular): el rojo neutro detecta la muerte celular también en las fases tempranas en que la membrana plasmática aún está intacta pero la función mitocondrial y lisosomal ya está comprometida. ## Aplicaciones en el contexto de las termitas **A) Histología del tubo digestivo y de los protozoos del paunch:** - En las secciones histológicas del intestino medio y del [[intestino]] posterior de termitas fijadas, el rojo neutro tiñe preferentemente los **lisosomas** de las células epiteliales columnares del intestino medio — los lisosomas son los orgánulos de secreción de las enzimas digestivas (celulasas, hemicelulasas, proteasas) en el intestino medio de los insectos, por lo que una alta densidad de lisosomas marcados con rojo neutro en el epitelio del intestino medio es señal de **alta actividad secretora**; en combinación con el **verde de Janus B** (_Janus Green B_; que marca las mitocondrias), la doble tinción rojo neutro + Janus Green B es el protocolo clásico de tinción supravital de tejidos de embrión e [[intestino]] de insectos in vivo. - En los **protozoos flagelados** del intestino posterior de las termitas inferiores (_Trichonympha_, _Spirotrichonympha_, _Dinenympha_, _Oxymonas_…), el rojo neutro tiñe las **vacuolas digestivas** (que en los flagelados son funcionalmente equivalentes a los lisosomas: contienen las endoglucanasas y glucosidasas que digieren las partículas de madera fagocitadas); en preparaciones en fresco del contenido del paunch diluido en solución fisiológica de insecto (NaCl 0,9% o Ringer de insecto), la adición de rojo neutro al 0,01% distingue inmediatamente entre flagelados vivos (vacuolas digestivas teñidas de rojo rosado intenso; el citoplasma permanece más claro) y flagelados muertos o no funcionales (no se tiñen); este protocolo es de gran utilidad para verificar la **viabilidad de la microbiota del paunch** en los experimentos de re-innoculación proctodeal o trofalaxis. **B) Ensayo NRU (_Neutral Red Uptake_) en toxicología de plaguicidas en termitas:** - El ensayo NRU (_neutral red uptake assay_; Repetto et al. 2008; protocolo OECD TG 432 para fotosensibilización in vitro y protocolo OECD TG 431 para corrosión cutánea in vitro) es el **ensayo de citotoxicidad in vitro más usado en toxicología de plaguicidas** cuando se trabaja con líneas celulares o células primarias de insectos; en el contexto de las termitas, el protocolo NRU se aplica con células intestinales primarias aisladas del [[intestino]] medio de _Reticulitermes_, _Coptotermes_ o _Macrotermes_, o con líneas celulares de Blattodea (ya que no existen líneas celulares establecidas de Isoptera a la fecha), para cuantificar la **citotoxicidad de IGR, insecticidas, biocidas o nanopartículas** expresada como concentración inhibidora al 50% de la viabilidad celular (IC₅₀): | Paso del protocolo NRU | Detalle técnico | | -------------------------------- | -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- | | **1. Siembra celular** | Células en placas de 96 pocillos; 24 h de cultivo hasta adherencia | | **2. Exposición al xenobiótico** | 24 h (o período de interés) con el compuesto a distintas concentraciones | | **3. Adición de rojo neutro** | Rojo neutro 0,033 mg/mL en medio de cultivo (sin cristales precipitados) → 2–3 h de incubación a 37 °C | | **4. Lavado** | Retirada del medio con rojo neutro; lavado con solución de formaldehído-CaCl₂ (1% formaldehído + 0,5% CaCl₂ en PBS) → fija las células y elimina el exceso de dye no incorporado | | **5. Extracción del dye** | Solución de extracción: etanol acidificado (50% etanol + 1% ácido acético glacial) → libera el rojo neutro de los lisosomas | | **6. Lectura** | Absorbancia a **540 nm** en espectrofotómetro de placa (λ de máxima absorción del NRH⁺ a pH ácido) | | **7. Cálculo de viabilidad** | % viabilidad = (Absorbancia muestra tratada / Absorbancia control sin tratamiento) × 100; IC₅₀ por análisis de regresión no lineal | **C) Rojo neutro como indicador de pH in vivo en el intestino de las termitas:** - Una aplicación menos conocida pero funcionalmente relevante es el uso del rojo neutro como **indicador colorimétrico de pH in situ** en los compartimentos del [[intestino]] posterior de las termitas; dado que el rojo neutro cambia de color de rojo (pH < 6,8) a amarillo-naranja (pH 6,8–8) a amarillo (pH > 8), la **alimentación de termitas con papel impregnado en rojo neutro al 0,01%** permite observar a simple vista (o con fotografía de alta resolución) el gradiente de pH de los compartimentos del intestino posterior al diseccionarlo bajo lupa: en las termitas inferiores (_[[Diccionario exhaustivo Termitología/RETICULITERMES|Reticulitermes]]_), el P1 y P3 deberían mostrar tonos rojos (pH neutro ~6,5–7); en los comedores de suelo de Termitidae, el P1 debería mostrar tonos amarillos o amarillo-verdosos (pH ≥ 9) claramente visibles a ojo; este protocolo es económico y adecuado para verificar cualitativamente los gradientes de pH ya medidos cuantitativamente con microelectrodos (Brune et al. 1995). **Ayuda para entender:** El rojo neutro es el equivalente del "papel tornasol" de los químicos pero a escala celular: el tornasol cambia de color según el pH de la solución en que se sumerge; el rojo neutro hace lo mismo, pero dentro de la célula — y específicamente dentro de sus lisosomas, que son las estructuras más ácidas de la célula; si los lisosomas están ácidos (célula viva, con ATP y ATPasa-H⁺ funcionando) → el dye queda atrapado en rojo; si los lisosomas no están ácidos (célula muerta o dañada) → el dye no queda atrapado y la célula aparece incolora. En el laboratorio de termitología, el rojo neutro resuelve tres problemas en una sola solución: (1) ¿están vivos los flagelados del paunch después de la disección? → microscopia en fresco + rojo neutro; (2) ¿en qué pH está el compartimento X del intestino posterior de esta especie? → termita alimentada con papel impregnado + disección + color del contenido intestinal; (3) ¿cuál es la IC₅₀ del [[noviflumuron]] sobre las células intestinales de _C. formosanus_? → ensayo NRU en 96 pocillos + lectura a 540 nm. **Sinónimos:** Rojo neutro (Esp.; denominación estándar; = _neutral red_ Ingl.); rojo tolueno (_toluylene red_; Ingl.; denominación alternativa de uso frecuente en industria y colorimetría); rojo básico 5 (_Basic Red 5_; Ingl.; denominación por la familia de colorantes básicos); C.I. 50040 (_Colour Index_ 50040; la denominación internacional de la industria de colorantes; número de clasificación inequívoco); NR (Ingl.; abreviatura estándar universal en la literatura científica: "neutral red uptake assay" → NRU assay; "neutral red staining" → NR staining); ensayo NRU (_neutral red uptake assay_; denominación del protocolo de toxicología in vitro basado en el rojo neutro; abreviatura NRU; también _NR assay_; protocolo OECD TG 432). **Términos relacionados:** Ensayo de viabilidad celular (_cell viability assay_; cualquier protocolo que mide la proporción de células vivas en un cultivo; el ensayo NRU es el más empleado para citotoxicidad de plaguicidas en insectos junto con el ensayo MTT [sal de tetrazolio; mide actividad mitocondrial] y el ensayo de exclusión de azul de tripán [exclusión de dye = célula viva; pero solo detecta muerte tardía]; el NRU es más sensible que el azul de tripán y más estable que el MTT a pH ácido); lisosoma (_lysosome_; el orgánulo diana del rojo neutro; pH luminal 4,5–5,5; mantiene el pH ácido por la actividad de la ATPasa-H⁺ dependiente de ATP; en los flagelados del paunch de las [[termitas]], las vacuolas digestivas son funcionalmente análogas a los lisosomas: contienen las GH celulolíticas, tienen pH ácido, y son marcadas por el rojo neutro supravital en preparaciones en fresco); IC₅₀ (_inhibitory concentration 50%_; la concentración del compuesto que reduce la viabilidad celular al 50% del control; el parámetro más usado para cuantificar la citotoxicidad en el ensayo NRU; calculada por regresión no lineal [curva sigmoidal] de los datos de absorbancia a 540 nm a distintas concentraciones); verde de Janus B (_Janus Green B_; colorante supravital catiónico que tiñe las mitocondrias de azul-verde en células vivas; su doble tinción con rojo neutro [mitocondrias en azul + lisosomas en rojo] es el protocolo clásico de tinción supravital de intestino de insectos in vivo y de blastómeros de embriones). **Bloque:** Técnicas / 124. Rojo neutro: **colorante supravital catiónico** (C.I. 50040; fórmula: C₁₅H₁₇ClN₄; PM: 288,78; pKa: 6,81; absorbancia máxima: 540 nm); mecanismo: a pH extracelular 7,4 → forma neutra (NR) → difusión pasiva → entra a los **lisosomas** → pH ácido lisosomal 4,5–5,5 → se protona (NRH⁺) → queda atrapado por gradiente de pH + unión electrostática → **solo células vivas (con ATPasa-H⁺ activa) retienen el dye**; células muertas = no retienen (sin gradiente de pH lisosomal); aplicaciones en termitas: (1) **histología intestinal**: tiñe lisosomas de células epiteliales del intestino medio (indicador de actividad secretora celulolítica) y **vacuolas digestivas de los flagelados del paunch** (vivos = vacuolas rojas; muertos = no teñido; utilidad: verificar viabilidad de la microbiota post-disección o post-reinoculación proctodeal); (2) **ensayo NRU** (protocolo OECD; placa 96 pocillos; 2–3 h con NR 0,033 mg/mL; lavado con formaldehído-CaCl₂; extracción con etanol acidificado; lectura 540 nm; IC₅₀ del xenobiótico sobre las células intestinales de la termita); (3) **indicador de pH in situ en el intestino posterior** (termita alimentada con papel impregnado en NR 0,01% → disección → color del contenido P3: rojo = pH 6–6,8; amarillo-naranja = pH 7–8; amarillo = pH ≥9; coherente con los gradientes medidos por microelectrodos por Brune et al. 1995); **indicador de pH**: rojo → amarillo a pH 6,8–8,0 (reversible); ventaja sobre el azul de tripán: detecta la muerte celular en fases tempranas (antes de la ruptura de la membrana plasmática). **Fuentes (source):** - Repetto, G. et al. (2008). _Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity_ (_Nature Protocols_ 3: 1125; PubMed 18600217). El protocolo NRU estándar; base del ensayo de citotoxicidad de plaguicidas; mecanismo de retención lisosomal; procedimiento en 96 pocillos; extracción con etanol acidificado; lectura 540 nm; más sensible que los ensayos de exclusión (azul de tripán) y más estable a pH ácido que el MTT. - Megías, M. et al. (Atlas de Histología; Universidad de Vigo). _Técnicas: Protocolo Rojo Neutro_. Protocolo de tinción supravital: 0,5 g NR + trazas de ácido acético glacial + 100 mL H₂O destilada; 1–5 min de tinción; tinción de núcleos y lisosomas en rojo; uso como indicador de pH (rojo a pH < 6,8; amarillo a pH > 8); doble tinción con verde de Janus B para tejidos embrionarios e intestino de insectos.[](https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/6-tecnicas/protocolos/s-colorante-rojo-neutro.php)​ - Wikipedia (en). _Neutral red_ (C.I. 50040; Basic Red 5; Toluylene Red). Dye eurodina; tiñe lisosomas en rojo; uso general en histología; contratinción; tinción del aparato de Golgi; gránulos de Nissl en neuronas; supravital con verde de Janus B para tejidos embrionarios.[](https://en.wikipedia.org/wiki/Neutral_red)​